Kevin Conroy, die bekend is van zijn rol als Batman in The Animated Series, liet tijdens de C2E3 stripboekconventie per ongeluk weten dat Two-Face zijn opwachting maakt in de game. Een andere schurk die zijn gezicht laat zien in Arkham Asylum 2 is Mr. Freeze, wiens stem ingesproken wordt door Maurice LaMarche.
Wraak
"Mr. Freeze wil wraak nemen, omdat.." vertelt LaMarche, "nou ja, ik kan de omstandigheden nog niet onthullen, maar in de game is hij een personage waar spelers medelijden mee krijgen." Tenslotte spreekt actrice Stana Katic de stem van Talia al Ghul, de dochter van Ra Al Ghul in. Er is op dit moment nog geen informatie beschikbaar over andere schurken die wellicht in de game zullen verschijnen.