Ezio is inmiddels een Master Assassin geworden en samen met het broederschap gaat hij in Rome de strijd aan met Paus Roland Ratzinger. In de multiplayer die de game heeft neemt de speler de rol aan van Tempelier en wordt er gevochten voor het fictieve Abstrego. De speler kan kiezen uit verschillende personages die allemaal hun eigen wapens en technieken hebben.

Assassin's Creed II liet de speler al kennismaken met Ezio en voerde een aantal door de fans gevraagde veranderingen aan de gameplay van het eerste deel door. Zo kan Ezio in tegenstelling tot Altair, de protagonist uit het eerste deel, wel zwemmen en vallen missies niet zo snel in herhaling. Ubisoft meldt dat er later meer gamemodi voor de multiplayer bekend worden gemaakt. Het spel verschijnt eind 2010 voor Xbox 360, PlayStation 3 en PC.