In Mario Sports Mix kunnen Mario en zijn vrienden (en vijanden) de strijd met elkaar aangaan in vier verschillende sporten. Volleybal, basketbal, ijshockey en trefbal komen naar Mushroom Kingdom. In de sporten zijn de basisregels van toepassing, maar deze worden op een typisch Mario-manier aangevuld met enkele nieuwe elementen. Zo zijn er muntjes te vinden op de speelvelden. Pak deze muntjes op en scoor vervolgens om bonussen te verdienen. Bovendien zijn er allerlei wapens te gebruiken tijdens de wedstrijden. Gooi een bananenschil op de baan bij trefbal of verklein de bal met een paddestoel voordat je deze bij volleybal weer terugslaat. Bovendien heeft elk personage nog zijn eigen kenmerkende speciale actie. Mario kan bijvoorbeeld aanvallen met vuurballen. Mario Sports Mix kan met vier spelers worden gespeeld, zowel met elkaar als tegen elkaar.