New Super Mario Bros. is een geheel nieuwe Mario platformgame die de gameplay van de 2D en 3D delen met elkaar combineert. Net als in de oorspronkelijke drie Super Mario Bros. games, ren, spring en klim je van links naar rechts terwijl je allerlei vijanden en obstakels overwint. Als toevoeging hierop is Mario nu voorzien van allerlei nieuwe moves die uit zijn recente driedimensionale avonturen afkomstig zijn. Ook is er nu een speciale power-up beschikbaar, die Mario tijdelijk heel groot laat worden. In deze vorm kun je het al slaand en schoppend tegen grotere tegenstanders opnemen. Het tweede scherm wordt gebruikt voor het managen van power-ups die je verzameld. Hiervan kun je er drie bewaren en door eentje met de stylus of je vinger aan te raken, kun je deze gebruiken. Daarnaast wordt het speelveld soms uitgebreid naar het onderste scherm wanneer je bijvoorbeeld een warppipe in gaat. Dankzij de WiFi functies kun je het spel nu ook tegelijk met twee spelers spelen, waarbij de tweede speler de rol van Luigi aanneemt. Naast een coop mode, is ook een competatieve mode voorhanden, waarbij je een race naar de finish houdt in allerlei levels. Hierbij staan allerlei speciale power-ups tot je beschikking. Het onderste scherm geef in deze mode aan waar jij en je tegenstander zich in het level bevinden. Voor een filmpje van de game, kun je hier kijken.