Professor Layton and the Diabolical Box volgt de professor en zijn jonge leerling Luke op hun treinreis om het mysterie van een moordlustige doos op te lossen. Iedereen die de doos opent, zal dit niet overleven. Ook Andrew Schroeder, de vroegere mentor van Layton, heeft eraan moeten geloven. Het is de taak aan Luke en Layton om zijn dood te onderzoeken.